Sanger sequencing

Na ligatie en transformatie van mijn plasmiden pX330 en pX459 was het tijd om te controleren of de guide RNA insert wel juist ingebouwd was. Een eerste controle was via PCR waarbij de ene primer bindt op de insert en de andere bindt op het plasmide. Door de reacties na PCR op een agarosegel te laden, was het makkelijk te achterhalen in welk epje de reactie heeft plaastgevonden en in welke niet. Doordat dit in sommige gevallen geen 100% zekerheid geeft of de insert juist is ingebouwd, werd elk staal nog eens gemeten via Sanger Sequencing. Hierbij worden de sequenties die gevormd werden door de forward primer en de sequenties gevormd door de reverse primer apart gemeten per staal. Nadien worden de resultaten dan vergeleken via Clustal Omega of de insertie aanwezig is in de bekomen sequenties. In Clustal Omega worden de bekomen fragmenten naast de sequentie van de plasmiden pX330 en pX459 met insert gezet en zo vergeleken.