Na drie maanden is het eindelijk zo ver! De plasmideconstructen zijn aangemaakt en voldoende geïsoleerd en gezuiverd. De eerste transformatietesten worden ingezet. Een eerste methode die ik heb uitgetest is transformatie via Lipofectamine LITX. Hierbij ben ik eerst nagegaan wat de transformatie-efficiëntie is van de methode. Daarvoor gebruik ik de K562 cellijn en plasmiden die kunnen coderen voor E-YFP. Na 24u werd de eerste test geanalyseerd via de flowcytometer en werden de cellen bekeken onder de fluorescentiemicroscoop. Een efficiëntie van 20% werd bekomen tijdens de eerste test.
Het echte doel tijdens mijn project is dat ik de plasmideconstructen transformeer naar K562-GFP via nucleofectie. Tijdens mijn stage moet ik werken met twee verschillende nucleofectie apparaten, namelijk de AMAXA en de NEON. Beide apparaten kunnen maar een week getest worden doordat AVANS deze nog niet in eigen bezit hebben. Na de meivakantie is het eerste apparaat aangekomen op AVANS, de AMAXA! Ook bij dit apparaat heb ik eerst een test uitgevoerd met K562 en het GFP dna vanuit de kit. Een efficiëntie van meer dan 80% werd behaald! Met deze informatie in het achterhoofd werden de eerste testen met het CRISPR Cas9 plasmiden en K562-GFP cellen.
Comments