Vooraleer optimalisatie van het Crispr-Cas9 modelsysteem kan plaatsvinden, is het noodzakelijk om de toxiciteit van TSA (trichostatine A) te bepalen. Volgens de literatuur zou TSA ervoor zorgen dat Neighbour End Joining geïnhibeerd zou worden waardoor de Homolohous Direct Repair naar voor zou komen. Korter gezegd, dankzij TSA zou meer BFP ingebouwd worden in het plasmide waardoor meer blauw licht zal waargenomen worden. De toxiciteit wordt daardoor eerst bepaald via een WST assay. Dit houdt in dat een reeks concentraties aan TSA worden aangemaakt en dan worden toegevoegd aan K562 en K562-GFP cellen. Wanneer cellen nog metabool actief zijn, wordt een specifieke stof gevormd wordt. Na incubatie wordt uiteindelijk WST reagens toegevoegd die zorgt voor een kleurverandering doordat het ene reactie aangaat met het stofje. Hoe hoger de concentratie aan TSA, hoe meer cellen sterven en ook hoe lager de kleurintensiteit zal zijn. Tijdens dit eerste experiment heb ik twee platen ingezet waarbij de ene 23u geïncubeerd heeft en de andere 72u. Zo wordt niet alleen de toxiciteit bepaald maar ook hoelang TSA bij de cellen kan aanwezig kan zijn.
- Sarah Beel